Western blotting adalah teknik dalam biologi molekuler yang digunakan untuk mendeteksi protein tertentu dalam sampel. Ini menggunakan SDS-PAGE untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dan protein yang dipisahkan ini kemudian ditransfer ke dalam membran. Teknik ini menggunakan antibodi primer spesifik dalam pelabelan protein tertentu dalam blot. Antibodi sekunder yang diberi label dengan protein reporter mendeteksi protein berlabel dengan antibodi primer.
Topik bahasan kami tentang:
- Apa Itu Western Blotting – Pengertian, Fakta, Aplikasi 2. Bagaimana Cara Kerja Western Blotting – Proses Western Blotting
Istilah Kunci: Perkembangan Warna, Membran Nitroselulosa, Antibodi Primer, Antibodi Sekunder, Western Blotting
Yang perlu anda ketahui tentang Western Blotting?
Western blotting adalah teknik hibridisasi yang digunakan dalam mendeteksi protein tertentu dalam sampel. Ini juga disebut imunoblotting karena teknik ini menggunakan antibodi untuk pelabelan protein yang diinginkan dan deteksi protein berlabel antibodi.
Gambar 1: Western Blot
Western blotting pertama kali dikembangkan oleh Towbin pada tahun 1979, dan saat ini digunakan sebagai teknik rutin analisis protein.
Bagaimana Cara Kerja Western Blotting?
Western blotting terutama digunakan dalam mendeteksi protein tertentu dalam sampel. Langkah-langkah teknik Western blotting dijelaskan di bawah ini.
- SDS-PAGE – Sampel protein dipisahkan berdasarkan ukurannya oleh SDS-PAGE.
- Mentransfer protein ke membran – Protein fraksinasi ukuran ditransfer ke membran nitroselulosa atau polivinilidena difluorida (PVDF). Teknik yang terlibat dalam transfer ini adalah transfer difusi.
- Memblokir situs non-spesifik – Situs kosong pada membran diblokir untuk mencegah pengikatan protein non-spesifik. Susu kering tanpa lemak atau Bovine serum albumin (BSA) dapat digunakan untuk tujuan ini.
- Inkubasi antibodi primer – Membran yang tersumbat diinkubasi dengan larutan antibodi primer. Antibodi primer ini mengikat protein tertentu pada membran.
- Inkubasi antibodi sekunder – Membran diinkubasi dengan antibodi sekunder, yang mengikat antibodi primer. Antibodi sekunder terkonjugasi dengan protein reporter. Protein reporter ini dapat berupa biotin, alkaline phosphatase atau horseradish peroxidase.
- Deteksi protein dengan pengembangan warna – Reporter enzim terkonjugasi bereaksi dengan substratnya untuk menghasilkan Alkaline phosphatase berwarna yang mengubah BCIP menjadi produk warna biru sementara horseradish peroxidase mengubah luminol, memancarkan cahaya.
Gambar 2: Western Blotting – Prosedur
Kata terakhir
Western blotting adalah teknik hibridisasi yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan protein tertentu dalam sampel. Ini menggunakan SDS-PAGE untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dan mengikat dengan antibodi primer, yang dapat dikenali oleh antibodi sekunder selama perkembangan warna.
Sumber bacaan:
- “Prinsip Dasar Western Blotting, Cara Kerja Western Blot.” Boster , Tersedia di sini .
Sumber gambar:
- “Imunoblot asam anti-lipoat” Oleh TimVickers – Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia 2. “Western Blotting” Oleh Cawang – Karya sendiri, CC0) melalui Commons Wikimedia
