Sekuensing DNA adalah teknik yang membantu menentukan urutan nukleotida dari molekul DNA tertentu. Dua metode pengurutan adalah pengurutan Sanger dan pengurutan generasi berikutnya. Kedua jenis metode pengurutan sepenuhnya otomatis terbaru. Setiap untai DNA terdiri dari empat nukleotida: adenin (A), guanin (G), sitosin (C), dan timin (T). Nukleotida dalam fragmen DNA diberi label dengan empat penanda fluoresen terpisah di kedua jenis metode sekuensing. Penanda fluoresen atau fluorofor adalah molekul yang mampu menyerap cahaya dan memancarkannya pada panjang gelombang yang ditentukan dengan baik. Penanda fluoresen dimasukkan ke dalam untai DNA dengan PCR . Kemudian urutan nukleotida ditentukan dengan teknik otomatis.
Topik bahasan kami tentang:
- Apa itu Sequencing – Definisi, Sanger Sequencing, Next-Generation Sequencing 2. Bagaimana Penanda Fluorescent Membantu Menentukan Urutan Nukleotida – Prosedur Sequencing
Istilah Kunci: Dideoxynucleotides (ddNTPs), Penanda Fluorescent, Elektroforesis Gel, Urutan Generasi Berikutnya, Urutan Nukleotida, PCR, Urutan Sanger
Yang perlu anda ketahui tentang Sequencing?
Sequencing adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk menentukan urutan nukleotida molekul DNA. Dua jenis utama metode pengurutan DNA dapat diidentifikasi sebagai pengurutan Sanger dan pengurutan generasi berikutnya. Baik sekuensing Sanger dan sekuensing generasi berikutnya menggunakan nukleotida berlabel dengan fluoresensi untuk penentuan urutan nukleotida.
Urutan Sanger
Pengurutan Sanger adalah metode pengurutan DNA yang pertama kali dikembangkan. Metode sequencing pertama kali dikembangkan oleh Fredric Sanger pada tahun 1975. Maka dari itu, dikenal sebagai Sanger sequencing. Metode sekuensing Sanger juga dikenal sebagai metode pemutusan rantai karena terlibat dalam penggabungan selektif dideoksinukleotida pengakhiran rantai (ddNTPS) oleh DNA polimerase selama sintesis DNA in vitro . Pemanjangan untai DNA dicapai oleh deoksinukleotida reguler (dNTPs). Namun, ddNTP ditambahkan ke campuran reaksi untuk menghentikan pertumbuhan rantai. ddNTP ini berlabel fluoresen. Keempat jenis ddNTP ditambahkan ke empat campuran PCR terpisah. Maka dari itu, empat reaksi PCR terpisah dilakukan dengan menambahkan ddATP, ddGTP, ddCTP, dan ddTTP. Dalam setiap campuran reaksi, pertumbuhan rantai diakhiri pada masing-masing nukleotida A, G, C, dan T. Sebagai contoh, dalam campuran reaksi dengan penambahan ddATP, pertumbuhan amplikon yang berbeda dihentikan pada setiap nukleotida A dalam fragmen DNA. Kemudian, keempat reaksi ini dipisahkan dengan elektroforesis gel , dan fluorometer digunakan untuk memindai fluoresensi yang terpisah. Sekuensing sanger banyak digunakan untuk penentuan urutan fragmen yang digunakan dalam kloning DNA dan fragmen yang diamplifikasi dengan PCR. Urutan nukleotida yang ditentukan ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1: Urutan DNA
Urutan Generasi Berikutnya
Teknologi pengurutan DNA terbaru secara kolektif dikenal sebagai pengurutan generasi berikutnya. Reaksi sekuensing dilakukan dalam skala mikro pada sebuah chip sekaligus. Maka dari itu, beberapa reaksi sekuensing dilakukan secara paralel. Dalam sekuensing generasi berikutnya, elektroforesis kapiler digunakan selain elektroforesis gel untuk pemisahan amlikon dengan berbagai panjang yang dibuat dengan metode pemutusan rantai. Elektroforesis kapiler adalah metode pemisahan analitik dimana molekul dipisahkan berdasarkan mobilitas elektroforesisnya.
Bagaimana Pembuat Fluorescent Membantu Menentukan Urutan Nukleotida
Selama sekuensing, DNA yang akan diurutkan berfungsi sebagai untai cetakan untuk sintesis DNA dengan PCR. Primer DNA digunakan untuk inisiasi sintesis DNA oleh DNA polimerase. Campuran reguler, empat basa (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) dan tingkat rendah dari salah satu dari empat dideoksinukleotida (ddNTPs; ddATP, ddGTP, ddCTP, dan ddTTP) ditambahkan sebagai komponen reaksi PCR. Maka dari itu, empat, reaksi PCR individu dilakukan dengan penambahan masing-masing dari empat ddNTP. Dideoksinukleotida memiliki dua karakteristik khusus:
- Mereka kekurangan gugus 3′-OH dimana nukleotida yang masuk ditambahkan oleh DNA polimerase. Maka dari itu, penggabungan ddNTP menghentikan pertumbuhan rantai.
- Mereka diberi label dengan pewarna fluoresen yang berbeda: ddATP diberi label dengan pewarna hijau , ddGTP diberi label dengan pewarna kuning , ddCTP diberi label dengan warna biru , dan ddTTP diberi label dengan pewarna merah .
Namun, ddNTP yang mengakhiri rantai ditambahkan dalam konsentrasi rendah; mereka tidak menghentikan seluruh proses PCR sekaligus. Namun, ketika salah satu dari empat ddNTP dimasukkan ke dalam rantai yang sedang tumbuh, pertumbuhan rantai tersebut dihentikan. Maka dari itu, pada akhir setiap empat reaksi PCR, serangkaian amplikon (fragmen DNA yang dihasilkan oleh PCR) diproduksi, yang diakhiri pada setiap nukleotida fragmen DNA target . Amplikon ini dapat dijalankan dalam gel. Pewarna fluoresen yang lewat pada titik tertentu dari gel elektroforesis dapat dipindai oleh fluorometer untuk menentukan urutan nukleotida dalam sekuenser DNA otomatis. Urutan nukleotida berlabel fluoresen yang diperoleh dalam sekuensing DNA ditunjukkan pada gambar 2 .
Gambar 2: Urutan Nukleotida Berlabel Fluoresen
Dengan menggabungkan masing-masing nukleotida dalam seri, urutan nukleotida dari fragmen DNA awal dapat ditentukan. Urutan nukleotida dari sebuah fragmen dengan 750-1.000 pasangan basa dapat dengan mudah ditentukan per run oleh sekuensing Sanger. Namun, pengurutan seluruh genom masih tetap menantang karena adanya sejumlah besar nukleotida. 454 sequencing adalah jenis sequencing generasi berikutnya dimana 20 juta pasangan basa dapat dibaca per run tunggal.
Kata terakhir
Sequencing adalah teknik yang digunakan dalam penentuan urutan nukleotida dari fragmen DNA tertentu. Pengurutan sanger dan pengurutan generasi berikutnya adalah dua teknologi pengurutan utama. Kedua teknologi menggunakan penanda fluoresen untuk penentuan urutan nukleotida. Masing-masing dari empat dideoksinukleotida pengakhiran rantai diberi label dengan empat pewarna fluoresen yang berbeda, dan mereka digunakan dalam empat reaksi PCR terpisah untuk mendapatkan urutannya.
Sumber bacaan:
- Adams, Jill U. “Teknologi Pengurutan DNA.” Berita Alam, Grup Penerbitan Alam, Tersedia di sini . 2. Sekuensing Carr, Steven M. Fluorescent, Tersedia di sini . 3. “Pengurutan DNA – Pengurutan Otomatis Dengan Pewarna Fluoresen.” Artikel JRank, Tersedia di sini .
Sumber gambar:
- “Alineando secuencias (2)” oleh Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) melalui Flickr 2. “Radioactive Fluorescent Seq” Oleh Abizar di Wikipedia bahasa Inggris (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia
