Transfeksi yang stabil adalah pengenalan DNA asing jangka panjang ke dalam sel. Sel-sel yang ditransfeksi secara stabil melewati DNA asing melalui keturunan. Maka dari itu, untuk membuat garis sel yang ditransfeksi secara stabil, DNA asing harus diintegrasikan ke dalam genom garis sel. Namun, pewarisan stabil dapat diamati pada DNA nongenomik juga. Transfeksi yang sukses dan stabil membutuhkan metode pengiriman DNA yang efektif serta metode seleksi untuk DNA asing di dalam garis sel. Garis sel yang ditransfusikan secara stabil digunakan untuk berbagai aplikasi seperti produksi protein rekombinan, studi fungsi gen, tes penemuan obat, dll.
Topik bahasan kami tentang:
- Cara Membuat Garis Sel Transfeksi Stabil – Protokol Pembuatan Garis Sel Stabil 2. Cara Memilih DNA Transfeksi dalam Garis Sel – Pemilihan Garis Sel Transfeksi Stabil
Istilah Kunci: Pemeliharaan Episomal, Integrasi ke dalam Genom, Plasmid, Seleksi, Garis Sel yang Ditransfusikan Secara Stabil
Cara Membuat Garis Sel Transfeksi Stabil
Transfeksi adalah metode transfer gen di mana materi genetik sengaja dimasukkan ke dalam sel inang dengan metode kimia atau non-kimia. Ada dua jenis garis sel yang ditransfeksi secara stabil:
- Jenis utama dari garis sel yang stabil dihasilkan oleh integrasi langsung dari DNA yang ditransfusikan ke dalam genom organisme inang. DNA yang ditransfusikan diintegrasikan ke dalam genom melalui rekombinasi homolog .
- Metode lain untuk menghasilkan garis sel yang stabil adalah pemeliharaan episomal DNA yang ditransfusikan. Vektor eukariotik digunakan dalam transfeksi DNA yang tidak terintegrasi ke dalam genom. Namun, stabilitas DNA episomal rendah. Juga, episom hanya dipelihara oleh jenis spesies tertentu. Garis sel yang ditransfeksi secara stabil ditunjukkan pada gambar 1 .
Gambar 1: Garis Sel yang Ditransfeksi Secara Stabil
Proses
Langkah-langkah yang terlibat dalam generasi garis sel yang stabil dijelaskan di bawah ini.
- Pembuatan kurva pembunuhan yang menentukan konsentrasi antibiotik pilihan yang optimal – Sel dikenai peningkatan jumlah konsentrasi antibiotik untuk menentukan konsentrasi antibiotik minimum yang diperlukan untuk membunuh semua sel selama seminggu.
- Transfeksi sel dengan konstruksi plasmid yang diinginkan – Metode transfeksi berbeda dengan jenis sel inang. Reagen liposom digunakan dalam transfeksi garis sel yang melekat. Elektrotransfeksi atau metode virus digunakan untuk mentransfeksi garis sel suspensi.
- Memilih dan memperluas koloni poliklonal yang stabil – Pada 48-72 jam transfeksi, antibiotik selektif konsentrasi tinggi, optimal, dan rendah ditambahkan ke kultur untuk mendapatkan garis sel yang ditransfeksi secara stabil.
Cara Memilih DNA yang Ditransfusikan dalam Garis Sel
Penanda seleksi diekspresikan bersama dengan DNA yang ditransfeksi untuk pemilihan sel yang berhasil ditransfusikan. Gen penanda dapat berada dalam vektor yang sama (cis) yang digunakan untuk mentransfeksi sel inang atau pada vektor lain (trans). Resistensi terhadap antibiotik seperti neomycin, zeocin, hygromycin, puromycin, DHFR, dll dapat digunakan dalam seleksi. Selain itu, gen yang ditransfeksi dapat ditandai dengan GFP.
Kata terakhir
Garis sel yang stabil dapat dibuat terutama dengan mengintegrasikan DNA yang ditransfusikan ke dalam genom. Selanjutnya, pemeliharaan episomal DNA yang ditransfeksi juga dapat digunakan untuk membuat garis sel yang stabil untuk jangka waktu yang lama pada beberapa organisme inang. Metode seleksi harus ada untuk identifikasi DNA yang ditransfusikan dalam garis sel.
Sumber bacaan:
- “Protokol Pembuatan Garis Sel Stabil.” BioMart Kreatif , Tersedia di sini .
Sumber gambar:
- “Knockout mouse production 2” Oleh Kjaergaard – Karya sendiri (CC BY 3.0) melalui Commons Wikimedia
