Mutagenesis terarah-situs (SDM) adalah metode in vitro untuk membuat mutasi dalam urutan yang diketahui. Hal ini sering dilakukan dengan metode berbasis PCR . Biasanya, satu atau dua basa diubah dalam mutagenesis terarah-situs. Primer dapat dirancang dengan mutasi yang diinginkan untuk memperkenalkan perubahan kecil pada urutan nukleotida . Ekstensi primer dan PCR terbalik dapat digunakan untuk memperkenalkan mutasi skala besar. Pendekatan ini dapat mengubah komposisi asam amino dari protein tertentu . Mutagenesis terarah-situs digunakan untuk mempelajari perubahan aktivitas protein. Ini juga digunakan untuk membuat protein fusi.
Topik bahasan kami tentang:
- Apa itu Mutagenesis Terarah Situs (SDM) – Definisi, Peran, Metode 2. Cara Mendesain Primer untuk Mutagenesis Berarah Situs – Substitusi, Penghapusan, Penyisipan
Istilah Kunci: Penghapusan, Penyisipan, Mutasi, Mutagenesis Langsung-Situs, Substitusi, PCR Tradisional
Yang perlu anda ketahui tentang Mutagenesis yang Diarahkan Situs
Mutagenesis terarah-situs adalah teknik biologi molekuler yang digunakan untuk memperkenalkan perubahan spesifik pada urutan nukleotida gen. Ini digunakan untuk mengubah urutan asam amino protein, memperkenalkan atau menghapus situs restriksi, menghancurkan situs pengikatan transkripsi, dan membuat protein fusi.
Proses
Selama mutagenesis terarah-situs, mutasi diperkenalkan ke plasmid menggunakan primer, yang terdiri dari mutasi yang diinginkan. Seluruh template diperkuat oleh PCR, menggabungkan mutasi ke dalam template. Kemudian, templat induk dikeluarkan dari sampel dengan menggunakan enzim, endonuklease yang bergantung pada metilasi. Produk PCR atau molekul plasmid nicked dengan mutasi yang diinginkan diubah menjadi bakteri. Plasmid dapat diisolasi dari bakteri dengan modifikasi yang diinginkan. Proses mutagenesis terarah-situs ditunjukkan pada gambar 1 .
Gambar 1: Mutagenesis yang Diarahkan Situs
Tiga jenis metode utama digunakan untuk memperkenalkan mutasi yang diinginkan dalam mutagenesis terarah-situs. Mereka adalah PCR tradisional, ekstensi primer, dan PCR terbalik. Ekstensi primer dan PCR terbalik dapat digunakan untuk memperkenalkan perubahan nukleotida skala besar.
PCR tradisional
PCR tradisional dapat digunakan untuk memperkenalkan satu atau dua perubahan nukleotida ke urutan target dengan primer yang dimodifikasi. Perubahan tersebut dapat berupa substitusi, penghapusan, atau penambahan nukleotida. Mutasi dimasukkan ke dalam amplikon selama PCR. Maka dari itu, urutan asli digantikan oleh urutan bermutasi di primer.
Ekstensi Primer
Dalam ekstensi primer, mutasi yang diinginkan digabungkan selama PCR bersarang. Di sini, urutan target diapit oleh dua primer. Mutasi yang diinginkan dimasukkan ke dalam primer internal dan, mutasi diperkenalkan pada putaran PCR kedua. Umumnya, spesifisitas reaksi PCR menurun dengan meningkatnya jumlah nukleotida yang tidak cocok dalam primer. Namun, primer internal yang panjang dengan mutasi skala besar dapat digunakan dalam ekstensi primer karena PCR bersarang dapat meningkatkan spesifisitas reaksi PCR.
PCR terbalik
Inverse PCR adalah metode amplifikasi fragmen DNA yang tidak diketahui dengan merancang primer ke urutan DNA yang diketahui. Dapat digunakan untuk mensubstitusi, menghapus, atau menyisipkan nukleotida dalam skala besar.
Aplikasi mutagenesis terarah-situs dijelaskan di bawah ini.
- Untuk mempelajari struktur, fungsi, dan sifat katalitik protein
- Untuk meningkatkan sifat protein (protein engineering)
- Untuk memperkenalkan atau menghapus situs endonuklease restriksi.
Cara Mendesain Primer untuk Mutagenesis yang Diarahkan Situs
Mutagenesis terarah-situs adalah proses memperkenalkan mutasi yang diinginkan melalui primer. Mutasi dapat berupa substitusi, penyisipan, atau penghapusan. Karena spesifisitas PCR menurun dengan meningkatnya nukleotida yang tidak cocok di primer, PCR tradisional hanya dapat memperkenalkan satu atau dua perubahan pasangan basa ke urutan target. Metode lain seperti ekstensi primer dan PCR terbalik dapat digunakan untuk memperkenalkan mutasi skala besar. Desain primer dalam mutagenesis terarah-situs ditunjukkan pada Gambar 2 .
Gambar 2: Primer untuk Mutagenesis yang Diarahkan Situs
Pengganti
Untuk substitusi, salah satu dari dua primer harus mengandung mutasi yang diinginkan di tengah primer. Di sini, situs yang berisi mutasi tidak sesuai dengan urutan target karena membentuk distorsi.
Penghapusan
Untuk penghapusan, urutan yang akan dihapus dari target dapat diabaikan selama desain primer. Karena urutan ini terletak terpisah dari daerah yang diapit oleh primer, itu tidak akan diamplifikasi selama PCR.
Insersi
Untuk penyisipan, urutan yang akan ditambahkan terjerat ke ujung 5′ salah satu primer selama desain primer. Maka dari itu, urutan yang dimasukkan dapat tetap melekat pada amplikon juga.
Kata terakhir
Mutagenesis terarah-situs adalah teknik yang digunakan untuk memasukkan mutasi ke dalam urutan DNA. Mutasi ini dapat berupa substitusi, penyisipan, atau penghapusan. Mutasi skala kecil dapat diperkenalkan dalam PCR tradisional. Mutasi skala besar dapat diperkenalkan pada ekstensi primer atau PCR terbalik. Pengenalan mutasi dilakukan dengan memasukkan mutasi yang diinginkan ke primer.
Sumber bacaan:
- “Metode untuk mutagenesis yang diarahkan situs.” TEKNOLOGI DNA TERPADU , Tersedia di sini .
Sumber gambar:
- “Mutagenesis yang Disutradarai oleh Situs” Oleh Knbusby – Karya sendiri (Domain Publik) melalui Commons Wikimedia
