Cara Membedakan PCR dan QPCR

Perbedaan Utama – PCR vs QPCR

PCR (polymerase chain reaction) dan qPCR (quantitative PCR) adalah dua teknik yang digunakan dalam bioteknologi untuk mengamplifikasi DNA untuk berbagai tujuan. PCR adalah teknik yang relatif sederhana. qPCR juga dikenal sebagai PCR waktu nyata atau PCR digital . Perbedaan yang menonjol antara PCR dan qPCR adalah PCR adalah teknik kualitatif sedangkan qPCR adalah teknik kuantitatif . PCR memungkinkan membaca hasil sebagai “ada atau tidaknya”. Tetapi dalam qPCR, jumlah DNA yang diamplifikasi dalam setiap siklus dikuantifikasi. Jika RNA digunakan dalam PCR, tekniknya dikenal sebagai RT-PCR (reverse transcription PCR), dan jika RNA digunakan dalam qPCR, tekniknya dikenal sebagai qRT-PC.

Topik bahasan kami tentang:

1. Apa Itu PCR – Pengertian, Proses, Kegunaan 2. Apa Itu QPCR – Pengertian, Proses, Kegunaan 3. Apa Persamaan Antara PCR dan QPCR – Garis Besar Karakteristik Umum 4. Apa Perbedaan Antara PCR dan QPCR – Perbandingan Perbedaan Kunci

Istilah Kunci: Elektroforesis Gel Agarosa, Amplikon, DNA polimerase, Pewarna Fluorescent, PCR, Probe, qPCR, RT-qPCR

Yang perlu anda ketahui tentang PCR?

PCR adalah istilah untuk teknik dalam bioteknologi yang memungkinkan analisis urutan pendek DNA dengan memperkuat segmen DNA yang dipilih. Ini adalah metode yang relatif sensitif karena volume yang sangat kecil diperlukan oleh reaksi tunggal. Teknik ini didasarkan pada kemampuan DNA polimerase untuk mensintesis untaian DNA baru ke untai cetakan yang ditawarkan secara komplementer. Campuran reaksi PCR terdiri dari DNA polimerase, nukleotida DNA , primer , template DNA yang akan diamplifikasi, dan magnesium. Amplifikasi dilakukan di dalam thermocycler. DNA polimerase harus tahan panas karena suhu tinggi digunakan dalam reaksi ini. Dua jenis DNA polimerase yang digunakan dalam PCR adalah Taq DNA polimerase dan Pfu DNA polimerase. Taq DNA polimerase banyak digunakan dalam PCR.

DNA polimerase membutuhkan untai DNA yang sudah ada sebelumnya di ujung 3′ untuk mensintesis untai baru. Maka dari itu, primer oligonukleotida ditambahkan ke campuran reaksi untuk inisiasi sintesis DNA. Persyaratan primer dalam PCR memungkinkan amplifikasi hanya wilayah tertentu dalam template. Urutan target diapit oleh primer maju dan mundur. Pada akhir PCR, salinan baru dari urutan DNA tertentu, yang disebut amplikon , terakumulasi dalam miliaran. Komponen PCR harus dioptimalkan sedemikian rupa untuk meningkatkan kinerja PCR sekaligus meminimalkan kegagalan. Reaksi PCR standar ditunjukkan pada gambar 1.

Gambar 1: PCR

Langkah-langkah PCR

Tiga langkah PCR dijelaskan di bawah ini.

1. Denaturasi – Template DNA untai ganda dipisahkan menjadi dua untai tunggal dengan pemanasan hingga 94-95 °C.
2. Annealing – Primer maju dan mundur mengikat urutan komplementer dalam template. Suhu tergantung pada suhu leleh kombinasi primer.
3. Ekstensi primer – Enzim DNA polimerase memperluas setiap primer pada ujung ke-3 dengan menambahkan basa komplementer ke untai yang sedang tumbuh. Suhu optimum Taq polimerase, yaitu 72 °C, digunakan sebagai suhu pada tahap ekstensi. Waktu perpanjangan tergantung pada jumlah pasangan basa dalam untai cetakan.

Ketiga langkah tersebut diulang sebanyak 28-35 kali. Elektroforesis gel agarosa digunakan dalam fraksinasi ukuran produk PCR. Produk diwarnai dengan etidium bromida dan diamati di bawah UV. Produk PCR atau DNA yang diamplifikasi dapat digunakan dalam kloning, sekuensing atau genotipe.

Yang perlu anda ketahui tentang QPCR

QPCR adalah istilah untuk teknik dalam bioteknologi yang memungkinkan deteksi, karakterisasi, dan kuantifikasi asam nukleat untuk berbagai aplikasi. Maka dari itu, ini adalah jenis PCR kuantitatif. Baik DNA dan RNA dapat digunakan sebagai qPCR. Jika RNA digunakan sebagai template, maka harus terlebih dahulu ditranskripsi terbalik menjadi cDNA . Dengan demikian, jenis qPCR ini dikenal sebagai RT-qPCR . PCR tradisional dilakukan untuk cDNA atau sampel DNA biasa. Namun, dalam qPCR, pewarna fluoresen digunakan untuk memberi label produk PCR di setiap langkah siklus PCR. Ini memungkinkan pengumpulan data saat PCR berlangsung, memungkinkan kuantifikasi amplikon selama fase eksponensial PCR. Jenis pewarna utama yang digunakan dalam qPCR adalah SYBR Green. Pewarna mengikat DNA untai ganda. Karena fluoresensi meningkat secara proporsional dengan jumlah DNA yang diamplifikasi, kuantifikasi dapat dilakukan dalam “waktu nyata”. Kerugian utama dari penggunaan pewarna adalah memungkinkan kuantifikasi satu produk tertentu dalam sampel. Selain pewarna, probe juga dapat digunakan dalam proses kuantifikasi. Probe TaqMan adalah salah satu jenis probe oligonukleotida utama yang digunakan dalam qPCR, dan proses emisi fluoresensi ditunjukkan pada gambar 2 .

Gambar 2: Penyelidikan TaqMan

Probe dapat dirancang sedemikian rupa untuk mendeteksi beberapa produk PCR dalam sampel yang sama. Probe TaqMan adalah salah satu jenis utama probe hidrolisis; penggabungan probe ini ke dalam produk PCR memaparkan fluorofor, memancarkan fluoresensi. Pewarna fluoresen lebih spesifik untuk produk PCR. Maka dari itu, mereka digunakan di sebagian besar tes diagnostik untuk mendeteksi produk PCR.

Persamaan Antara PCR dan QPCR

• PCR dan qPCR adalah dua jenis teknik yang digunakan dalam bioteknologi untuk mengamplifikasi DNA untuk berbagai tujuan.
• Reaksi berantai polimerase tradisional dilakukan sebagai teknik inti dalam PCR dan qPCR.
• RNA dapat digunakan baik dalam PCR maupun qPCR dengan menggunakan transkripsi balik sebagai reaksi pertama.

Perbedaan Antara PCR dan QPCR

Definisi

PCR: PCR adalah teknik dalam bioteknologi yang memungkinkan analisis urutan pendek DNA dengan memperkuat segmen DNA yang dipilih.

QPCR: QPCR adalah teknik dalam bioteknologi yang memungkinkan deteksi, karakterisasi, dan kuantifikasi asam nukleat untuk berbagai aplikasi.

Kuantitatif Kualitatif

PCR: PCR adalah teknik kualitatif.

QPCR: QPCR adalah teknik kuantitatif.

Deteksi Produk

PCR: Produk dideteksi dengan elektroforesis gel agarosa di PCR.

QPCR: Produk dapat dideteksi pada setiap siklus amplifikasi dalam qPCR.

Pengumpulan Data

PCR: Data dikumpulkan pada akhir reaksi di PCR.

QPCR: Data dikumpulkan selama fase eksponensial reaksi dalam qPCR.

Resolusi

PCR: PCR memiliki resolusi yang sangat buruk.

QPCR: QPCR memiliki resolusi yang sangat tinggi.

pewarna

PCR: PCR menggunakan etidium bromida untuk menodai produk selama PCR.

QPCR: QPCR menggunakan pewarna fluoresen untuk mendeteksi produk.

Waktu

PCR: PCR adalah metode yang lebih memakan waktu.

QPCR: QPCR kurang memakan waktu.

RNA

PCR: RT-PCR adalah jenis PCR yang menggunakan RNA sebagai template.

QPCR: RT-qPCR adalah jenis qPCR yang menggunakan RNA sebagai template.

Peran

PCR: PCR digunakan untuk mendeteksi ada tidaknya fragmen genom tertentu.

QPCR: QPCR digunakan untuk mengukur fragmen tertentu dalam sampel.

Kata terakhir

PCR dan qPCR adalah dua jenis teknik yang digunakan dalam bioteknologi untuk mengamplifikasi DNA untuk berbagai tujuan. PCR adalah metode amplifikasi tradisional yang digunakan untuk mengidentifikasi ada atau tidak adanya fragmen DNA. QPCR digunakan untuk mengukur fragmen tertentu dalam sampel. Jadi, PCR adalah teknik kualitatif sedangkan qPCR adalah teknik kuantitatif. Inilah Perbedaan yang menonjol antara PCR dan qPCR.

Sumber bacaan:

1. “QPCR vs. PCR Digital vs. PCR Tradisional.” Thermo Fisher Scientific , Tersedia di sini.

Sumber gambar:

1. “PCR” Oleh Madprime – Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia 2. “Taqman” Oleh Pengguna: Braindamaged – Karya sendiri oleh pengunggah asli (Domain Publik) mela
   lui Commons Wikimedia