Cara Membedakan Cara Membuat Primer untuk PCR

Primer merupakan komponen penting dalam amplifikasi DNA baik secara in vivo dan secara invitro . In vivo , enzim, DNA polimerase membutuhkan primer untuk inisiasi replikasi DNA . Secara in vitro , primer banyak digunakan untuk inisiasi polymerase chain reaction (PCR) . Beberapa teknik lain termasuk pengurutan, kloning , mutagenesis terarah-situs, dll. memerlukan primer. Maka dari itu, perancangan primer untuk teknik in vitro menjadi cukup sederhana tetapi merupakan proses yang menantang bagi ahli biologi molekuler. Maka dari itu, aturan dasar untuk desain primer untuk PCR dan sekuensing dibahas dalam artikel ini.

Topik bahasan kami tentang:

1. Apa itu Primer – Pengertian, Jenis, Peranan 2. Cara Kerja Primer dalam PCR – Ciri-Ciri DNA, Proses PCR 3. Cara Membuat Primer untuk PCR – Aturan Dasar Merancang Primer PCR 4. Cara Merancang Sequencing Primer – Karakteristik Sequencing Primers

Istilah Kunci: Sintesis DNA, Forward Primers, Panjang, Melting Temperature, PCR, Reverse Primers, Sequencing Primers

Yang perlu anda ketahui tentang Primer?

Primer adalah untaian pendek DNA atau RNA yang berfungsi sebagai titik awal untuk sintesis DNA. Enzim yang mengkatalisis replikasi DNA mampu menambahkan nukleotida ke ujung 3′ yang ada. Maka dari itu, primer meletakkan dasar untuk sintesis DNA dengan berfungsi sebagai prima. Primer RNA digunakan di dalam sel untuk inisiasi replikasi DNA oleh DNA polimerase. Namun, primer DNA sintetis dapat digunakan untuk amplifikasi DNA, terutama dengan PCR dan teknik lainnya. Dua jenis primer digunakan dalam PCR, dan mereka dikenal sebagai primer maju dan mundur. Selama PCR, jutaan salinan fragmen DNA yang diinginkan dapat diproduksi dengan mengapit urutan DNA tertentu dalam DNA genom dengan primer maju dan mundur. Primer maju dan mundur yang mengapit urutan DNA tertentu ditunjukkan pada Gambar 1 .

Gambar 1: Primer Maju dan Mundur

Bagaimana Primer Bekerja di PCR

DNA adalah molekul yang memiliki dua untai yang disatukan. Pola pasangan basa saling melengkapi pada masing-masing untaian. Kedua untai disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa nitrogen komplementer. Selain itu, setiap helai memiliki arahnya sendiri. Satu untai memiliki arah 5′ hingga 3′ sementara yang lain memiliki arah 3′ hingga 5′. Maka dari itu, kedua untai tersebut antiparalel. Untai dengan arah 5′ hingga 3′ dikenal sebagai untai sense sedangkan untai dengan arah 3′ hingga 5′ dikenal sebagai untai antisense . Setiap dua untai harus disintesis secara individual selama PCR.

Tiga langkah PCR adalah denaturasi, annealing, dan elongasi. Dalam denaturasi, kedua untai DNA dipisahkan dengan memutus ikatan hidrogen dengan pemanasan hingga 95 °C. Forward primer berikatan dengan sense strand sedangkan reverse primer berikatan dengan antisense strand. Anil primer terjadi ketika suhu turun dari 95 °C menjadi 50-60 °C. Maka dari itu, kedua untai dapat disintesis pada saat yang sama dengan bantuan Taq polimerase. Amplifikasi untaian indra dan antisense terjadi pada arah 5′ hingga 3′. Karena PCR adalah reaksi eksponensial, tiga langkah diulang dalam 25-35 siklus. Kedua primer maju dan mundur digunakan dalam setiap siklus untuk menghasilkan sekitar ²³⁵ salinan fragmen DNA yang diinginkan. Peran primer dalam PCR ditunjukkan pada gambar 2 .

Gambar 2: PCR

Cara Membuat Primer untuk PCR

Untuk mengamplifikasi fragmen DNA tertentu dalam genom, fragmen DNA tertentu harus diapit oleh primer maju dan mundur. Maka dari itu, kedua primer harus saling melengkapi dengan sekuens yang mengapit fragmen DNA. Pedoman dasar untuk keberhasilan desain primer PCR dijelaskan di bawah ini.

1. Arah primer maju dan mundur harus 5′ hingga 3′.
2. Panjang masing-masing primer harus antara 18 hingga 25 nukleotida.
3. Kandungan GC primer antara 40 dan 60% dan adanya C atau G di ujung 3 primer dapat meningkatkan pengikatan.
4. Suhu leleh dan Tm (suhu di mana setengah dari primer telah dianil ke template) dari pasangan primer harus sama dan di atas 60 °C. Perbedaan maksimum harus 5 °C.
5. Ujung 3′ dari primer harus sama persis dengan DNA cetakan.
6. Setidaknya basa 2G atau C (penjepit GC) harus ada di 5 basa terakhir di ujung 3′ primer. Penjepit GC mempromosikan pengikatan yang kuat ke urutan target.
7. Situs restriksi dengan 5-6 nukleotida dapat ditambahkan ke ujung 5′ primer.
8. Pengulangan dinukleotida (ATATATAT) atau pengulangan nukleotida yang sama lebih dari 4 kali (ACCCC) harus dihindari dalam urutan primer. Hal ini menyebabkan mispriming.
9. Homologi intra-primer atau struktur sekunder primer harus dihindari. Homologi antar-primer atau sekuens komplementer dalam primer maju dan mundur harus dihindari. Kedua kondisi tersebut dapat membentuk self-dimer atau primer-dimer.
10. Nilai G untuk analisis dimer harus antara 0 hingga 9 kkal/mol.

Banyak alat online yang tersedia untuk kemudahan desain primer seperti Primer 3 , Primer X , NetPrimer , DNAstrar , dll. Kekhususan primer yang dirancang dapat ditentukan oleh alat seperti NCBI Primer-BLAST atau UCSC in-silico PCR .

Gambar 3: Antarmuka Primer 3

Bagaimana Mendesain Primer Sequencing

Primer sequencing pendek, untai DNA, seperti primer PCR. Namun, primer PCR dirancang untuk amplifikasi fragmen DNA tertentu sementara primer sekuensing digunakan untuk mengungkapkan urutan nukleotida fragmen DNA yang diamplifikasi dengan PCR. Tidak seperti primer PCR, primer tunggal dapat digunakan dalam sekuensing, jika hanya sekuens target yang panjangnya kurang dari 500 bp. Sebagai contoh, primer maju dari PCR dapat digunakan dalam sekuensing, untuk memperkuat hanya untai indra. Selain itu, tingkat ketidaksesuaian yang ditoleransi selama reaksi sekuensing lebih tinggi daripada PCR. Umumnya, primer PCR melengkapi urutan target. Namun, beberapa primer sekuensing tidak terkait dengan sekuens target. Mereka dikenal sebagai primer universal. Primer universal seperti T7 atau SP6 anil ke vektor yang membawa urutan target. Mereka dapat digunakan untuk berbagai vektor dan berbagai jenis fragmen DNA.

Kata terakhir

Primer digunakan dalam PCR dan sekuensing untuk inisiasi sintesis DNA. Dua jenis primer PCR dapat diidentifikasi sebagai primer maju dan mundur. Forward primer anneal ke sense strand sedangkan reverse primers anneal ke antisense strand. Dalam pengurutan, baik primer maju atau mundur dapat digunakan untuk memperkuat target. Selama perancangan primer, banyak faktor yang harus dipertimbangkan seperti panjang primer, Tm, dan kandungan GC. Banyak alat online tersedia yang dapat digunakan untuk merancang primer untuk urutan tertentu.

Sumber bacaan:

1. “Desain Primer: Kiat untuk Proses yang Efisien.” Genome Compiler Corporation, 3 November 2015, Tersedia di sini . 2. “Sequencing primer dan desain primer.” Sequencing primer dan desain primer, University of Calgary, Tersedia di sini .

Sumber gambar:

1. “Primers RevComp” Oleh Zephyris – Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia 2. “Reaksi berantai polimerase” Oleh Enzoklop – Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia