PCR kuantitatif atau real-time digunakan sebagai uji rutin untuk memantau perubahan relatif dalam ekspresi gen di bawah kondisi eksperimental yang berbeda. Merancang primer serta probe selama QPCR adalah salah satu faktor paling penting yang mempengaruhi kualitas dan keberhasilan pengujian. Beberapa pedoman berlaku untuk desain primer untuk QPCR: Kandungan GC primer harus 35-65%; suhu leleh primer harus berada dalam 60-68 °C; kita juga harus menghindari struktur sekunder, pengulangan Gs atau Cs yang lebih panjang dari 3 basa, dan pembentukan primer-dimer.
Topik bahasan kami tentang:
- Apa itu QPCR – Pengertian, Proses, Kegunaan 2. Cara Merancang Primer untuk QPCR – Pedoman Desain Primer untuk QPCR
Istilah Kunci: Pewarna Fluoresen, Kandungan GC, Suhu Leleh, Primer, PCR Kuantitatif (QPCR)
Yang perlu anda ketahui tentang QPCR
QPCR adalah jenis PCR yang memungkinkan kuantifikasi produk secara real time. Pewarna fluoresen dapat digunakan dalam kuantifikasi produk PCR dengan memberi label pada setiap langkah. Dua metode pelabelan fluoresen dapat digunakan dalam pengujian QPCR. Mereka adalah penggunaan pewarna fluoresen dan probe berlabel fluoresensi. Pewarna fluoresen mengikat produk PCR sementara probe menyatu dengan produk PCR untuk membentuk DNA tripleks yang stabil. Pewarna fluoresen yang banyak digunakan di QPCCR adalah SYBR Green sedangkan probenya bisa berupa Taqman. Penggunaan probe dalam mendeteksi produk PCR selama QPCR memberikan hasil yang lebih akurat dan meningkatkan sensitivitas pengujian.
Gambar 1: Mekanisme QPCR
Cara Mendesain Primer untuk QPCR
Perancangan primer untuk QPCR sangat penting dalam meningkatkan keandalan, akurasi serta sensitivitas pengujian. Pedoman untuk desain primer QPCR dijelaskan di bawah ini.
- Produk PCR/Ukuran Amplikon – Ukuran produk PCR harus berukuran 50-210 pasangan basa.
- Panjang primer – Panjang primer harus 19-23 nukleotida.
- Konten GC – Kandungan GC primer harus 35-65%.
- Temperatur leleh (Tm) – Temperatur leleh primer harus 60-68 °C. Suhu anil untuk pengujian adalah 5 °C lebih rendah dari Tm primer.
- Sambungan ekson-ekson – Saat memperkuat cDNA oleh QPCR, primer harus menjangkau sambungan ekson-ekson untuk menghindari amplifikasi DNA yang terkontaminasi.
- Berulang dan berjalan – Pengulangan dinukleotida ( TCTCTCTCTC) dan nukleotida berulang (misalnya TAAAAAAAGC) harus dihindari.
- 3′ Komplementaritas – Daerah komplementer dari ujung 3′ primer maju dan mundur harus dihindari untuk mencegah pembentukan dimer primer.
- Stabilitas 3′ – Residu G atau C harus dimasukkan pada ujung 3′ primer untuk meningkatkan stabilitas annealing.
- Klem GC – Satu atau dua klem GC di ujung 5′ primer meningkatkan spesifisitas anil.
- Spesifisitas – Spesifisitas primer harus diperiksa oleh BLAST
- SNP – Primer tidak boleh mengandung variasi SNP (single nucleotide polymorphism) yang diketahui
Beberapa alat online dapat digunakan dalam desain primer di QPCR seperti Primer3 , Primer-BLAST , IDT PrimerQuest , Primer Bank , dan OAT .
Gambar 2: Pembentukan Primer-Dimer
Primer harus didesain sedemikian rupa untuk menghindari terbentuknya primer-dimer pada QPCR. Sangat penting ketika menggunakan pewarna fluoresen untuk mendeteksi produk PCR karena pewarna ini juga mengikat dengan primer-dimer untuk memberikan hasil positif palsu.
Kata terakhir
QPCR digunakan dalam deteksi dan kuantifikasi produk PCR. Perancangan primer sangat penting dalam QPCR untuk meningkatkan akurasi hasil. Maka dari itu, penting untuk mengikuti panduan dalam merancang primer untuk QPCR dengan hati-hati.
Sumber bacaan:
- “Desain dan Optimasi Pengujian QPCR.” LSR | Bio-Rad, Tersedia di sini .
Gambar Courtesy:
- “Taqman” Oleh Pengguna: Braindamaged – Karya sendiri oleh pengunggah asli (Domain Publik) melalui Commons Wikimedia 2. “Pembentukan dimer primer En” Oleh Tzachi Bar – Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia
