Mengenai perbedaan antara immunoblot dan western blot, imunoblot adalah nama yang lebih akurat untuk western blot, yang merupakan teknik dalam biologi molekuler dan imunogenetik untuk mendeteksi protein spesifik yang ada dalam sampel. Karena antibodi mengambil bagian dalam proses western blot, itu dapat lebih tepat disebut sebagai imunoblot. Maka dari itu, tidak ada perbedaan yang signifikan antara immunoblot dan western blot dalam prinsip, metodologi atau aplikasi.
Pada dasarnya, pada western blot, protein mengalami denaturasi dan pemisahan ukuran dengan elektroforesis gel . Selanjutnya, pita protein yang terpisah dipindahkan ke membran pembawa seperti nitroselulosa atau PVDF dalam proses yang dikenal sebagai blotting. Pada akhirnya, antibodi terkonjugasi dengan fluorescent, label radioaktif atau enzim reporter mengambil bagian dalam pengenalan protein spesifik pada membran.
Topik bahasan kami tentang:
- Apa itu Immunoblot – Deskripsi Singkat 2. Apa Metodologi Immunoblot – Pemuatan Protein yang Sama, Pemisahan Protein, Transfer Elektroforesis, Penyelidikan Antibodi 3. Apa Aplikasi Immunoblot – Dalam Biokimia, Dalam Aplikasi Klinis 4. Apa itu Western Blot – Deskripsi Singkat
Istilah Utama
Deteksi Protein, Imunoblot, Antibodi Primer, Antibodi Sekunder, Western Blot
Yang perlu anda ketahui tentang Immunoblot?
Immunoblot adalah teknik yang paling sering digunakan dalam biologi molekuler serta imunogenetik untuk mendeteksi protein tertentu dalam sampel. Umumnya, teknik ini lebih spesifik disebut sebagai ‘immunoblot’ karena penggunaan anti untuk mendeteksi protein.
Gambar 1: Imunoblot
Selain itu, laboratorium Harry Towbin di Institut Friedrich Miescher di Basel, Swiss mengembangkan metode ini. Di sini, prinsip-prinsip imunoblot mencakup pemuatan protein yang sama, pemisahan protein berdasarkan berat molekul, transfer protein elektroforesis ke membran yang sesuai, dan pemeriksaan antibodi.
Metodologi Imunoblot
Pemuatan Protein yang Sama
Biasanya, penting untuk memiliki konsentrasi protein yang sama per setiap sampel dalam imunoblot. Pada dasarnya, tiga komponen dari setiap sampel adalah ekstrak protein, buffer lisis sel, dan buffer sampel. Di sini, buffer lisis sel penting untuk normalisasi ekstrak protein ke konsentrasi protein yang diinginkan. Selanjutnya, buffer sampel atau buffer Laemmli unik untuk preparasi sampel imunoblot. Ini berisi reagen, yang memainkan fungsi di SDS-PAGE . Juga mengandung Tris-HCl pH 6,80 gliserol, SDS, beta-mercaptoethanol, dan bromophenol blue.
Tris-HCl pH 6,80 bekerja dalam konjugasi dengan sistem buffer terputus-putus. Juga, gliserol menambah kepadatan sampel saat memuat. Selain itu, SDS adalah deterjen ionik yang kuat, melapisi protein terdenaturasi dengan rasio anion terhadap massa yang sama. Dengan demikian, ini menutupi muatan, ukuran, dan bentuk protein, memungkinkan pemisahan protein sebagai fungsi dari berat molekulnya. Sementara itu, beta-mercaptoethanol mengurangi ikatan disulfida, yang mempertahankan bentuk protein sampai batas tertentu. Selanjutnya, bromofenol biru berfungsi sebagai bagian depan pewarna selama elektroforesis gel.
Pemisahan Protein Berdasarkan Berat Molekul
Setelah di atas, SDS-PAGE memungkinkan pemisahan sampel berdasarkan berat molekul dengan bantuan deterjen dan sistem buffer terputus-putus. Umumnya, sampel didenaturasi dengan panas sebelum dimasukkan ke dalam gel, memastikan pemisahan melalui berat molekul monomer. Juga, deterjen di SDS-PAGE adalah SDS.
Gambar 2: SDS-PAGE
Selain itu, sistem buffer terputus-putus mencakup dua buffer; menjalankan buffer dan buffer elektroda.
Transfer Elektroforesis
Biasanya, beberapa metode blotting melibatkan transfer elektroforesis protein ke membran yang berbeda. Namun, prinsip mereka serupa, yaitu migrasi sampel bermuatan negatif menuju anoda.
Gambar 3: Transfer Elektroforesis
Dalam proses ini, nitroselulosa adalah standar emas sebagai membran sampai munculnya membran PVDF. Yang penting, membran ini memiliki kapasitas pengikatan protein yang lebih tinggi dibandingkan dengan yang pertama.
Pemeriksaan Antibodi
Pada akhirnya, dua jenis antibodi mengambil bagian dalam penyelidikan dan analisis. Mereka adalah antibodi primer dan sekunder. Sekarang, protein ada di membran. Maka dari itu, antibodi primer secara langsung mengikat ke daerah spesifik protein pada membran. Sementara itu, antibodi sekunder secara tidak langsung mengikat protein spesifik melalui antibodi primer. Yang penting, pemblokiran adalah prosedurnya, yang melapisi area permukaan yang tersisa pada membran sebelum pemeriksaan antibodi. Dengan demikian, ini mengurangi latar belakang, menghilangkan positif palsu. Juga, buffer pemblokiran mengandung kasein atau bovine serum albumin (BSA); semua memiliki afinitas rendah terhadap protein sampel. Selain itu, langkah pencucian setelah inkubasi membran dengan masing-masing dari dua jenis antibodi juga penting untuk pengurangan latar belakang.
Gambar 4: Pemeriksaan Antibodi
Selain itu, antibodi sekunder biasanya berkonjugasi dengan komponen khusus untuk analisis. Di sini, komponen ini dapat berupa isotop radioaktif, fluorofor atau lebih umum enzim reporter seperti horseradish peroxidase (HRP) atau alkaline phosphatase (AP). Yang penting, penggunaan enzim dalam analisis dalam metode chemiluminescence memungkinkan deteksi antibodi terikat pada membran melalui analisis kolorimetri.
Gambar 5: Deteksi Chemiluminescent
Akhirnya, visualisasi pita pada membran memverifikasi keberadaan protein spesifik pada antibodi primer yang digunakan.
Aplikasi
Biasanya, dalam biokimia, imunoblot sangat penting untuk deteksi kualitatif protein tunggal atau modifikasi protein. Juga, ukuran dan intensitas warna pita memberikan analisis semi-kualitatif. Maka dari itu, imunoblot penting dalam verifikasi produksi protein setelah kloning.
Secara klinis, imunoblot memainkan peran kunci dalam deteksi antibodi anti-HIV dalam serum dan urin. Biasanya, penting untuk mengkonfirmasi diagnosis HIV setelah tes ELISA, yang dapat memberikan hasil positif palsu. Juga, penting untuk mendeteksi varian Penyakit Creutzfeldt-Jakob, Bovine spongiform encephalopathy atau penyakit sapi gila, penyakit Lyme, dll.
Yang perlu anda ketahui tentang Western Blot?
‘Western blot’ adalah nama lain untuk imunoblot, yang mendeteksi protein tertentu dalam sampel. Namun, istilah ‘western blot’ diciptakan oleh W. Neal Burnette pada tahun 1981 setelah blot selatan eponymous untuk DNA. Sementara itu, Southern blot dikembangkan oleh ahli biologi Inggris Edwin Southern untuk mendeteksi urutan DNA spesifik pada membran blot. Juga, ‘northern blot’ adalah teknik untuk mendeteksi RNA yang dikembangkan pada tahun 1977 oleh James Alwine, David Kemp, dan George Stark di Stanford University, dengan kontribusi dari Gerhard Heinrich.
Perbedaan Antara Imunoblot dan Western Blot
- Tidak ada perbedaan yang signifikan antara immunoblot dan western blot. Namun, imunoblot adalah nama yang lebih tepat untuk teknik ini karena penggunaan antibodi untuk mendeteksi protein dalam sampel.
Kata terakhir
Immunoblot adalah teknik dalam biologi molekuler untuk mendeteksi protein tertentu dalam sampel dengan menggunakan antibodi. Jadi, karena penggunaan antibodi untuk tujuan deteksi, nama yang lebih tepat untuk teknik ini adalah imunoblot. Namun, ini juga dikenal sebagai ‘western blot’ untuk mewakili teknik yang berlawanan, yaitu Southern blot, mendeteksi urutan DNA spesifik dalam noda. Mengenai prosesnya, imunoblot melibatkan pemisahan ukuran protein terdenaturasi pada gel diikuti dengan mentransfer fragmen yang dihasilkan ke dalam membran. Akhirnya, antibodi berlabel mengikat protein spesifik pada membran. Maka dari itu, berdasarkan akun ini, tidak ada perbedaan yang signifikan antara immunoblot dan western blot dalam hal prinsip, metodologi
, atau aplikasi.
Sumber bacaan:
- Gavini K, Parameshwaran K. Western Blot (Protein Immunoblot) [Diperbarui 7 Juni 2019]. Di: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): Penerbitan StatPearls; 2019 Jan-. Tersedia Di Sini .
Sumber gambar:
- “Imunoblot asam anti-lipoat” Oleh TimVickers – Karya sendiri ( CC BY-SA 3.0 ) melalui Commons Wikimedia 2. “Elektroforesis SDS-PAGE” Oleh Bensaccount di Wikipedia bahasa Inggris ( CC BY 3.0 ) melalui Commons Wikimedia 3. “Transfer Western blot” Oleh Bensaccount di Wikipedia bahasa Inggris ( CC BY 3.0 ) melalui Commons Wikimedia 4. “Western Blot binding” Oleh Bensaccount di Wikipedia bahasa Inggris ( CC BY 3.0 ) melalui Commons Wikimedia 5. “Deteksi chemiluminescent blot Barat” Oleh Bensaccount di Wikipedia bahasa Inggris ( CC BY 3.0 ) melalui Commons Wikimedia
