DNA adalah teknik yang digunakan untuk menentukan urutan nukleotida dari fragmen DNA tertentu. Pengurutan sanger dan pengurutan generasi berikutnya adalah dua jenis metode pengurutan. Penanda fluoresen digunakan untuk mengidentifikasi setiap nukleotida dalam urutan. PCR digunakan untuk memasukkan penanda fluoresen ke dalam fragmen DNA. PCR (polymerase chain reaction) adalah teknik yang digunakan di laboratorium untuk menghasilkan jutaan salinan fragmen DNA tertentu. Analisis fragmen PCR dalam gel memungkinkan penentuan urutan nukleotida fragmen DNA.
Topik bahasan kami tentang:
- Apa itu Sequencing – Pengertian, Jenis-Jenis Sequencing – Next-Generation Sequencing, Sanger Sequencing 2. Mengapa PCR Digunakan dalam Proses DNA Sequencing – Penggabungan Pewarna Fluorescent Selama PCR
Istilah Utama: ddNTPs, dNTPs, Pengurutan DNA, Pewarna Fluoresen, Pengurutan Generasi Selanjutnya, PCR, Pengurutan Sanger
Yang perlu anda ketahui tentang Sequencing?
Sequencing adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk menentukan urutan nukleotida molekul DNA. Pengurutan sanger dan pengurutan generasi berikutnya adalah dua metode utama pengurutan DNA. Kedua metode sekuensing DNA terlibat dalam penggabungan pembuat fluoresen ke untai DNA oleh PCR untuk penentuan urutan nukleotida dari untai DNA tertentu.
Urutan Sanger
Metode pengurutan pertama, yang dikenal sebagai pengurutan Sanger, pertama kali dikembangkan oleh Fredric Sanger pada tahun 1975. Maka dari itu, dikenal sebagai pengurutan Sanger. Sekuensing sanger terlibat dalam penggabungan selektif dideoksinukleotida pengakhiran rantai (ddNTPS) oleh DNA polimerase selama sintesis DNA in vitro . Maka dari itu, metode ini juga dikenal sebagai metode pemutusan rantai. Regular deoxynucleotides (dNTPs) digunakan untuk pemanjangan untai DNA. ddNTPs juga ditambahkan ke campuran reaksi untuk penghentian pertumbuhan rantai. Keempat jenis ddNTP ditambahkan ke empat campuran PCR terpisah. Maka dari itu, empat reaksi PCR terpisah dilakukan dengan menambahkan ddATP, ddGTP, ddCTP, dan ddTTP. Untuk setiap campuran reaksi, satu jenis ddNTP yang ditambahkan (jika ddATP ditambahkan), pertumbuhan amplikon yang berbeda dihentikan pada setiap (A) nukleotida dalam fragmen DNA. Kemudian keempat reaksi tersebut dipisahkan dengan elektroforesis gel. Fluoresensi yang dipancarkan dideteksi oleh fluorometer. Sekuensing sanger banyak digunakan untuk penentuan urutan fragmen yang digunakan dalam kloning DNA dan fragmen yang diamplifikasi dengan PCR. Prosedur umum sekuensing Sanger ditunjukkan pada gambar 1 .
Gambar 1: Proses Umum Pengurutan Sanger
Urutan generasi berikutnya
Pengurutan generasi berikutnya adalah nama kolektif untuk teknologi pengurutan DNA terbaru. Beberapa reaksi sekuensing dilakukan dalam skala mikro pada sebuah chip sekaligus dalam sekuensing generasi berikutnya. Kedua metode sekuensing menggunakan nukleotida berlabel dengan fluoresensi yang dimasukkan ke dalam amplikon selama PCR, memungkinkan penentuan urutan nukleotida. Penambahan rantai pengakhiran penanda fluoresen juga terlibat dalam pengurutan generasi berikutnya. Namun, Perbedaan yang menonjol antara sekuensing Sanger dan sekuensing generasi berikutnya adalah penggunaan elektroforesis kapiler untuk pemisahan amplikon berlabel berbeda dalam sekuensing generasi berikutnya. Elektroforesis kapiler adalah metode pemisahan analitik dimana molekul dipisahkan berdasarkan mobilitas elektroforesisnya.
Mengapa PCR Digunakan dalam Proses Sequencing DNA
Selama pengurutan, penanda fluoresen harus dimasukkan ke dalam untai DNA untuk penentuan urutan nukleotida. Penggabungan ini terjadi selama PCR. Umumnya, keempat jenis dNTP digabungkan ke dalam untai DNA yang baru disintesis selama PCR. Fenomena ini digunakan dalam sekuensing DNA untuk memasukkan dideoksinukleotida berlabel fluoresen (ddNTPs) ke dalam amplikon sambil menentukan urutan DNA.
Umumnya, campuran empat basa biasa (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) ditambahkan ke campuran reaksi PCR selama sekuensing DNA.
Selain itu, salah satu dari empat dideoksinukleotida (ddNTPs; ddATP, ddGTP, ddCTP, dan ddTTP) ditambahkan sebagai komponen reaksi PCR dalam konsentrasi rendah. Akhirnya, empat reaksi PCR harus dilakukan untuk menentukan urutan yang lengkap.
Gambar 1: Urutan DNA yang Ditentukan
ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH dimana nukleotida yang masuk ditambahkan oleh DNA polimerase . Maka dari itu, penggabungan ddNTP menghentikan pertumbuhan rantai. Jadi, di masing-masing dari empat reaksi PCR, pemutusan rantai terjadi pada basa tertentu. ddNTP ini juga digabungkan dengan pewarna fluoresen yang berbeda ( ddATP diberi label dengan pewarna hijau; ddGTP diberi label dengan pewarna kuning; ddCTP diberi label dengan warna biru , dan ddTTP diberi label dengan pewarna merah ). Penggabungan pewarna fluoresen dan pemutusan rantai berlangsung selama PCR. Amplikon dijalankan pada gel, dan gel dipindai untuk fluoresensi oleh fluorometer dalam sequencer otomatis untuk penentuan urutan nukleotida.
Kata terakhir
Sekuensing DNA adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk menentukan urutan nukleotida dari fragmen DNA tertentu. Sequencing Sanger dan sekuensing generasi berikutnya menggabungkan pewarna fluoresen yang berbeda ke dalam fragmen DNA untuk penentuan urutan nukleotida selama PCR.
Sumber bacaan:
- Adams, Jill U. “Teknologi Pengurutan DNA.” Berita Alam, Grup Penerbitan Alam, Tersedia di sini . 2. “Pengurutan DNA – Pengurutan Otomatis Dengan Pewarna Fluoresen.” Artikel JRank, Tersedia di sini .
Sumber gambar:
- “Pengurutan Sanger – umum” ор: Pengguna: Fibonachi – асна обота (CC BY-SA 1.0) melalui Commons Wikimedia [dimodifikasi] 2. “Urutan DNA” Oleh Sjef – Karya sendiri (Domain Publik) melalui Commons Wikimedia
