Perbedaan Utama – PCR vs RT-PCR
PCR dan RT-PCR adalah dua teknik penting dalam biologi molekuler. PCR dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1980-an. Ia mampu meningkatkan jumlah salinan gen tertentu secara eksponensial, memfasilitasi deteksi fragmen DNA tertentu. Taq Polymerase adalah enzim yang paling sering digunakan dalam sistem PCR. Ini adalah enzim termostabil. Dalam RT-PCR, transkripsi balik diikuti oleh PCR. Enzim, reverse transcriptase terlibat dalam sintesis DNA komplementer dari RNA . Perbedaan yang menonjol antara PCR dan RT-PCR adalah PCR menggunakan DNA untai ganda sebagai templat sedangkan RT-PCR menggunakan RNA sebagai templat.
Topik bahasan kami tentang:
- Apa itu PCR? – Pengertian, Proses, Aplikasi 2. Apa itu RT PCR – Pengertian, Karakteristik, Aplikasi 3. Apa perbedaan antara PCR dan RT PCR – Perbandingan Perbedaan Kunci
Istilah Kunci: PCR, RT-PCR, Reaksi Rantai Polimerase, Reaksi Rantai Transkripsi-Polimerase Terbalik, Template DNA, DNA Polimerase, Denaturasi, Annealing, Ekstensi Primer
Yang perlu anda ketahui tentang PCR?
PCR ( Polymerase Chain Reaction ) adalah metode yang relatif sederhana namun revolusioner. PCR menggunakan kemampuan enzim, DNA polimerase untuk mensintesis untaian DNA baru secara komplementer dengan untai templat yang ditawarkan. PCR adalah teknik yang sangat diperlukan yang digunakan di laboratorium klinis dan penelitian untuk analisis fungsional gen, diagnosis, dan pemantauan penyakit keturunan, kloning DNA, pengurutan, dan amplifikasi DNA purba. Template DNA, nukleotida , primer, dan DNA polimerase adalah empat komponen utama PCR. Template DNA biasanya berupa DNA untai ganda dengan urutan target, yang akan diamplifikasi. Taq DNA polimerase yang diisolasi dari tanaman akuatik Thermus umumnya digunakan dalam PCR. Pfu DNA polimerase adalah jenis lain dari DNA polimerase dengan fidelitas tinggi. Baik Taq dan Pfu polimerase tahan panas. Nukleotida yang ditambahkan oleh DNA polimerase adalah adenin (A), guanin (G), sitosin (C), dan timin (T) . Karena DNA polimerase hanya dapat menambahkan nukleotida baru ke dalam ujung 3′ dari untai DNA yang sudah ada sebelumnya, primer oligonukleotida diperlukan untuk inisiasi sintesis DNA. Persyaratan primer dalam PCR memungkinkan penggambaran hanya wilayah tertentu dalam template. Urutan target diapit oleh primer maju dan mundur. Pada akhir PCR, salinan baru yang disebut amplikon dari sekuens DNA spesifik terakumulasi dalam miliaran. Komponen PCR harus dioptimalkan sedemikian rupa untuk meningkatkan kinerja PCR sekaligus meminimalkan kegagalan.
PCR adalah proses otomatis yang dilakukan oleh pengendara sepeda termal, yang mampu beralih di antara suhu yang berbeda. PCR adalah proses tiga langkah.
- Denaturasi – Template DNA untai ganda dipisahkan menjadi dua untai tunggal dengan pemanasan hingga 94-95 °C.
- Annealing – Primer maju dan mundur mengikat urutan komplementer dalam template. Suhu langkah ini tergantung pada suhu leleh kombinasi primer.
- Ekstensi primer – Enzim DNA polimerase memperluas masing-masing primer pada ujung 3 dengan menambahkan basa komplementer ke untai yang sedang tumbuh. Suhu optimum Taq polimerase, 72 °C digunakan sebagai suhu pada tahap ekstensi. Waktu perpanjangan tergantung pada jumlah pasangan basa dalam untai cetakan.
Ketiga langkah tersebut diulang sebanyak 28-35 kali.
Gambar 1: Reaksi Rantai Polimerase
Produk PCR difraksinasi ukurannya dengan elektroforesis gel agarosa dibandingkan dengan tangga DNA. Visualisasi DNA pada gel agarosa dilakukan dengan pewarnaan dengan etidium bromida dan pengamatan di bawah sinar UV. Pita DNA yang diperkuat di bawah UV dalam gel diwarnai etidium bromida ditunjukkan pada Gambar 2. Tangga DNA ditunjukkan di sumur paling kiri.
Gambar 2: pita DNA
Yang perlu anda ketahui tentang RT-PCR?
RT-PCR ( Reverse transcription-polymerase chain reaction ) adalah salah satu teknik paling sensitif yang digunakan untuk mendeteksi mRNA . RNA adalah template yang tepat untuk mengumpulkan informasi baik pada ekspresi gen dari jaringan normal atau ekspresi gen dari jaringan yang terinfeksi. Template untuk RT-PCR dapat berupa RNA total atau RNA virus atau bakteri. RNA ditranskripsi balik menjadi DNA komplementer (cDNA) oleh enzim, reverse transcriptase. Suhu optimum reverse transcriptase adalah 46 °C. cDNA digunakan dalam PCR untuk mendapatkan produk. Langkah-langkah dalam PCR transkripsi terbalik ditunjukkan pada gambar 3 .
Gambar 3: RT-PCR
RT-PCR dapat dilakukan dalam reaksi dua langkah atau satu langkah. Dalam reaksi dua langkah, transkripsi balik dan PCR dilakukan dalam dua langkah terpisah. Dalam RT-PCR satu langkah, transkripsi balik diikuti oleh PCR dalam satu tabung secara berurutan. Baik cDNA dan produk PCR akhir dapat dijalankan pada gel agarosa untuk fraksinasi ukuran dan tujuan visualisasi. RT-PCR satu langkah dan dua langkah ditunjukkan pada gambar 4.
Gambar 4: RT-PCR satu langkah dan dua langkah
Perbedaan Antara PCR dan RT-PCR
Definisi
PCR: PCR adalah teknik yang digunakan dalam biologi molekuler untuk mengamplifikasi segmen DNA yang menghasilkan jutaan salinan urutan DNA.
RT-PCR: RT-PCR adalah varian dari PCR yang digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen dalam biologi molekuler.
Langkah
PCR: Denaturasi, annealing, dan ekstensi adalah tiga langkah dalam PCR.
RT-PCR: Dalam RT-PCR, transkripsi balik diikuti oleh PCR.
Templat
PCR: Sebuah molekul DNA untai ganda berfungsi sebagai template untuk PCR.
RT-PCR: Sebuah molekul RNA untai tunggal berfungsi sebagai template untuk transkripsi terbalik. Sebuah molekul DNA untai tunggal berfungsi sebagai template untuk PCR.
Enzim yang Digunakan
PCR: DNA polimerase digunakan sebagai enzim dalam PCR.
RT-PCR: Reverse transcriptase dan DNA polimerase digunakan sebagai enzim dalam RT-PCR.
Primer
PCR: Primer maju dan mundur digunakan dalam PCR.
RT-PCR: Hanya primer terbalik yang digunakan untuk transkripsi balik dan primer maju dan mundur digunakan dalam PCR.
Kepekaan
PCR: PCR adalah metode yang sensitif.
RT-PCR: RT-PCR lebih sensitif dari PCR.
Aplikasi
PCR: PCR digunakan dalam analisis fungsional gen, diagnosis, dan pemantauan penyakit keturunan, kloning DNA, sekuensing DNA, dan amplifikasi DNA purba.
RT-PCR: RT-PCR digunakan dalam mendeteksi ekspresi gen.
Kata terakhir
PCR dan RT-PCR adalah dua teknik penting yang digunakan dalam biologi molekuler. Baik PCR dan RT-PCR adalah teknik otomatis yang mampu meningkatkan jumlah salinan urutan DNA target secara eksponensial, yang ditentukan oleh primer maju dan mundur. Dalam PCR, DNA untai ganda digunakan sebagai cetakan. Dengan PCR, kloning DNA, sekuensing DNA, dan analisis fungsional gen dapat dilakukan. Dalam RT-PCR, ekspresi gen dalam jaringan tertentu dapat diamati dengan memperkuat RNA. Perbedaan yang menonjol antara PCR dan RT-PCR adalah pada template yang digunakan dalam setiap reaksi dan aplikasinya.
Referensi:
- “Reaksi Berantai Polimerase (PCR).” Pusat Nasional Informasi Bioteknologi. Perpustakaan Kedokteran Nasional AS, dan Web. Tersedia di sini . 01 Juni 2017. 2. “Reaksi Rantai Polimerase (atau PCR).” Kloning dan Analisis Molekuler Gen. Np, dan Web. Tersedia di sini . 01 Juni 2017. 3. Biolabs, New England. “Sintesis CDNA & RT-PCR.” Sintesis CDNA & RT-PCR | COTOK. Np, dan Web. Tersedia di sini . 01 Juni 2017.
Gambar Courtesy:
- “Reaksi berantai polimerase” Oleh Enzoklop – Pekerjaan sendiri (CC BY-SA 3. 0) melalui Commons Wikimedia 2. “DNA fragmentid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis.” Oleh Rainis Venta – Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia 3. “Reverse transcription polymerase chain reaction” Oleh Jpark623 – Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia 4.
“Satu langkah vs dua langkah RT-PCR” Oleh Jpark623 – Karya sendiri (C
C BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia
