Perbedaan yang menonjol antara sekuensing Sanger dan pyrosequencing adalah sekuensing Sanger adalah pendekatan sekuensing DNA yang menggunakan metode pemutusan rantai dideoksi, sedangkan pyrosequencing adalah pendekatan sekuensing DNA berdasarkan prinsip sekuensing-by-sintesis. Maka dari itu, pada sekuensing Sanger, identifikasi nukleotida dilakukan dengan elektroforesis kapiler setelah amplifikasi seluruh fragmen DNA sedangkan pada pirosekuens, identifikasi nukleotida dilakukan dengan pelepasan pirofosfat selama sintesis.
Sequencing sanger dan pyrosequencing adalah dua metode sekuensing DNA; yang pertama adalah ‘standar emas’ untuk sebagian besar target sedangkan yang kedua adalah alternatif pertama untuk metode pengurutan Sanger konvensional.
Topik bahasan kami tentang:
- Apa itu Sanger Sequencing – Definisi, Proses, Pentingnya 2. Apa itu Pyrosequencing – Definisi, Proses, Pentingnya 3. Apa Persamaan Antara Sanger Sequencing dan Pyrosequencing – Garis Besar Karakteristik Umum 4. Apa Perbedaan Antara Sanger Sequencing dan Pyrosequencing – Perbandingan Perbedaan Kunci
Istilah Utama
Pengurutan DNA, PCR, Pirofosfat, Pirosekuens, Pengurutan Sanger, Sensitivitas
Yang perlu anda ketahui tentang Urutan Sanger
Pengurutan Sanger adalah metode generasi pertama pengurutan DNA yang pertama kali dikembangkan oleh Fredric Sanger pada tahun 1977. Selain itu, dasar pengurutan Sanger adalah metode pemutusan rantai dideoksi.
Urutan Sanger – Prosedur
Dalam sekuensing Sanger, DNA polimerase bertanggung jawab atas penggabungan selektif dideoksinukleotida pemutus rantai (ddNTPs) selama sintesis DNA in vitro. Maka dari itu, dideoksinukleotida (ddNTPs) diberi label fluoresen ke dalam amplikon oleh PCR . Di sini, ddATP diberi label dengan pewarna hijau; ddGTP diberi label dengan pewarna kuning; ddCTP diberi label dengan warna biru, dan ddTTP diberi label dengan pewarna merah) Kemudian, amplikon yang dihasilkan dipisahkan dengan elektroforesis kapiler sambil mendeteksi nukleotida berlabel fluoresen.
Gambar 1: Metode Pengurutan Sanger
Urutan Sanger – Pentingnya
Namun, metode sekuensing Sanger memiliki beberapa keterbatasan termasuk ketidakmampuan untuk memproses keluaran sekuensing yang lebih lama, analisis paralel sampel yang lebih sedikit, ketidakmampuan otomatisasi total preparasi sampel, biaya lebih tinggi, kesalahan pengurutan, sensitivitas kurang (10-20%), yang tidak cukup untuk mendeteksi alel mutan tingkat rendah, dll. Terlepas dari keterbatasan ini, ini adalah ‘standar emas’ untuk pengurutan dalam banyak prosedur klinis.
Yang perlu anda ketahui tentang Pyrosequencing?
Pyrosequencing adalah alternatif pertama untuk pengurutan Sanger konvensional. Ini adalah jenis sekuensing generasi berikutnya yang dikembangkan di Royal Institute of Technology (KTH). Selain itu, metode ini didasarkan pada deteksi luminometrik pirofosfat (PPi) yang dilepaskan selama penggabungan nukleotida katalis DNA polimerase yang diarahkan primer.
Pyrosequencing – Prosedur
Umumnya, empat enzim digunakan dalam metode ini untuk secara akurat mendeteksi nukleotida yang tergabung. Mereka adalah DNA polimerase, ATP sulfurylase, luciferase, dan apyrase. Selain itu, primer sekuensing berhibridisasi menjadi templat berlabel biotin DNA untai tunggal. Selain itu, empat deoksinukleotida trifosfat (dNTPs), adenosin 5′ fosfosulfat (APS) dan luciferin adalah substrat dalam campuran reaksi.
Gambar 2: Metode Pyrosequencing
Ketika kaskade polimerisasi dimulai, PPi anorganik dilepaskan sebagai hasil penggabungan nukleotida oleh polimerase. Namun, jumlah PPi yang dilepaskan sama dengan jumlah nukleotida yang tergabung dalam setiap siklus. Selanjutnya, ATP sulfurilase mengubah PPi yang dilepaskan menjadi ATP dengan adanya APS secara kuantitatif. ATP yang dihasilkan mendorong konversi luciferin menjadi oxyluciferin yang dimediasi oleh enzim luciferase. Juga, reaksi ini secara proporsional menghasilkan cahaya tampak dengan jumlah ATP. Kemudian, cahaya ini dapat dideteksi pada panjang gelombang 560 nm.
Selain itu, fungsi utama enzim apyrase adalah untuk terus mendegradasi ATP serta dNTP yang tidak tergabung dalam campuran reaksi. Maka dari itu, dNTP baru harus ditambahkan ke reaksi satu per satu dalam interval waktu tertentu, yaitu 65 detik. Sebagai nukleotida yang ditambahkan diketahui, urutan template dapat ditentukan.
Pyrosequencing – Pentingnya
Selain itu, pyrosequencing adalah teknik yang dapat diterapkan secara luas dengan akurasi tinggi, pemrosesan paralel, dan mudah otomatis. Juga, menghindari penggunaan primer berlabel, nukleotida berlabel, dan elektroforesis gel. Selain itu, ini cocok untuk pengurutan konfirmasi dan pengurutan de novo. Lebih lanjut, karakteristik penting utama dari pyrosequencing adalah kedalaman sekuensingnya, yang memungkinkan pendeteksian varian dengan sensitivitas tinggi. Namun, kelemahan utama dari teknik ini adalah kesesuaiannya untuk mengurutkan hingga beberapa ratus basis.
Persamaan Antara Pengurutan Sanger dan Pyrosequencing
- Sekuensing sanger dan pyrosequencing adalah dua pendekatan untuk sekuensing DNA.
- Mereka bertanggung jawab untuk mengidentifikasi urutan nukleotida dari fragmen DNA yang diinginkan.
- Keduanya lebih baik untuk mengurutkan fragmen DNA yang lebih kecil.
- Namun, mereka memiliki aplikasi mereka sendiri tergantung pada prosedur dan manfaat pengurutan mereka.
Perbedaan Antara Pengurutan Sanger dan Pyrosequencing
Definisi
Sekuensing sanger adalah istilah untuk metode pengurutan DNA dengan penggabungan selektif dideoksinukleotida pengakhiran rantai, sedangkan pyrosequencing adalah istilah untuk metode pengurutan DNA berdasarkan prinsip pengurutan-oleh-sintesis.
Jenis Urutan
Pengurutan sanger adalah pendekatan pengurutan generasi pertama, sedangkan pyrosequencing adalah kimia pengurutan generasi berikutnya, yang merupakan pendekatan pengurutan generasi kedua.
Korelasi
Selain itu, sequencing Sanger adalah metode konvensional dan ‘standar emas’ untuk sebagian besar target, sedangkan pyrosequencing adalah alternatif pertama untuk metode sequencing konvensional.
Penemuan
Frederick Sanger dan rekan-rekannya adalah yang pertama mengembangkan sekuensing Sanger pada 1977 sementara Pål Nyrén dan muridnya Mostafa Ronaghi adalah yang pertama mengembangkan pyrosequencing, di Royal Institute of Technology di Stockholm pada 1996.
Komersialisasi
Sementara sekuensing Sanger pertama kali dikomersialkan oleh Applied Biosystems, pyrosequencing digunakan dalam platform Roche 454 dan GS FLX Titanium.
Prinsip
Di atas segalanya, Perbedaan yang menonjol antara sekuensing Sanger dan pyrosequencing adalah sekuensing Sanger menggunakan metode pemutusan rantai dideoksi, sedangkan pyrosequencing didasarkan pada prinsip sekuensing-oleh-sintesis.
Identifikasi Nukleotida
Pada sekuensing Sanger, identifikasi nukleotida dilakukan dengan elektroforesis kapiler setelah amplifikasi seluruh fragmen DNA sedangkan pada pirosekuens, identifikasi nukleotida dilakukan dengan pelepasan pirofosfat selama sintesis.
Deteksi
Selanjutnya, sekuensing Sanger melibatkan deteksi cahaya fluoresen, sedangkan pyrosequencing melibatkan deteksi cahaya tampak pada 560 nm.
Panjang Fragmen DNA
Selain itu, sekuensing Sanger dapat membaca hingga 800 hingga 1000 pasangan basa sementara pyrosequencing dapat membaca hingga 300-500 pasangan basa.
Makna
Sequencing sanger adalah proses yang kompleks dengan banyak langkah, sedangkan pyrosequencing adalah proses yang kurang kompleks dengan langkah yang lebih sedikit.
Kepekaan
Juga, perbedaan lain antara sekuensing Sanger dan pyrosequencing adalah sekuensing Sanger memiliki sensitivitas yang lebih rendah, sedangkan pyrosequencing memiliki sensitivitas yang
lebih tinggi.
Kata terakhir
Pengurutan Sanger adalah pendekatan pengurutan gen
erasi pertama, yang merupakan metode pengurutan konvensional. Juga, ini adalah ‘standar emas’ untuk banyak target. Namun, menggunakan metode pemutusan rantai dideoksi diikuti oleh elektroforesis kapiler. Di sisi lain, pyrosequencing adalah alternatif pertama untuk pengurutan Sanger, dan ini adalah jenis pengurutan generasi berikutnya. Selanjutnya, ia memiliki sensitivitas yang lebih tinggi dan langkah-langkah yang lebih sedikit untuk ditutupi. Umumnya, ia menggunakan metode sequencing-by-sintesis, yang menentukan nukleotida selama sintesis fragmen DNA apa adanya. Maka dari itu, Perbedaan yang menonjol antara sequencing Sanger dan pyrosequencing adalah metode pengurutan dan manfaatnya.
Sumber bacaan:
- Fakruddin, Md, dan Abhijit Chowdhury. “Pyrosequencing-Alternatif untuk Pengurutan Sanger Tradisional.” American Journal of Biochemistry and Biotechnology , vol. 8, tidak. 1, 2012, hlm. 14–20., doi: 10.3844/ajbbsp.2012.14.20 .
Sumber gambar:
- “Pengurutan Sanger” Oleh Estevezj – Karya sendiri ( CC BY-SA 3.0 ) melalui Commons Wikimedia 2. “Cara Kerja Pyrosequencing” Oleh “Jacopo Pompilii, DensityDesign Research Lab”. – Karya sendiri ( CC BY-SA 4.0 ) melalui Commons Wikimedia
