Kombinasi oligo-dT/carrier terutama digunakan dalam pemurnian mRNA dari RNA total dengan teknik yang dikenal sebagai kromatografi afinitas. Ada dua metode utama untuk mengisolasi mRNA dari total RNA berdasarkan jenis sel; yaitu, metode isolasi mRNA langsung dan metode minus isolasi mRNA. Kedua metode dijelaskan dalam artikel ini.
Messenger RNA (mRNA) adalah produk transkripsi, yang terdiri dari serangkaian nukleotida RNA. Ini membawa informasi dalam gen dari nukleus ke sitoplasma untuk sintesis protein. Isolasi RNA dari garis sel tertentu menghasilkan RNA total, yang terdiri dari rRNA dan tRNA bersama dengan mRNA. Maka dari itu, mRNA harus dipisahkan dari campuran RNA total selama studi transkriptom garis sel. Sifat unik mRNA seperti adanya ekor poli(A) pada ujung 3′ molekul mRNA digunakan untuk pemisahan. Karena molekul oligo-dT saling melengkapi dengan ekor poli(A), mRNA dapat diisolasi dari campuran RNA total.
Topik bahasan kami tentang:
- Apa itu mRNA – Pengertian, Struktur, Fungsi 2. Apa Komposisi Total RNA – mRNA, rRNA, tRNA 3. Cara Isolasi mRNA dari Total RNA – Penggunaan Oligo-dT/Molekul Pembawa
Istilah Kunci: Kromatografi Afinitas, Messenger RNA (mRNA), Metode Minus, Oligo dT, ekor Poli(A), RNA Total
Yang perlu anda ketahui tentang mRNA
mRNA adalah transkrip dari gen penyandi protein. Ini diproduksi di dalam nukleus pada eukariota dan membawa informasi untuk produksi protein tertentu ke dalam sitoplasma. Ini diterjemahkan ke dalam urutan asam amino protein selama terjemahan, dibantu oleh ribosom. Transkrip utama yang dihasilkan oleh transkripsi eukariota disebut pra-mRNA.
Gambar 1: Struktur mRNA
Selama modifikasi pasca-transkripsi, molekul mRNA matang diproduksi dengan beberapa karakteristik seperti tutup 5′ dan ekor poli(A). Total mRNA organisme tertentu dikenal sebagai transkriptomnya.
Apa Komposisi Total RNA
Hasil isolasi RNA disebut RNA total. Ini terdiri dari ketiga jenis utama RNA yang diproduksi oleh sel. Mereka adalah mRNA, tRNA, dan rRNA. Baik tRNA dan rRNA membantu dalam translasi. Ukuran mRNA eukariotik adalah 0,5-20 kb. Transfer RNA (tRNA) membawa asam amino yang sesuai selama translasi. Panjangnya 76-90 pasangan basa dan terdiri dari daerah antikodon, yang melengkapi kodon tertentu pada mRNA. RNA ribosom (rRNA) adalah komponen ribosom. Beberapa rRNA manusia memiliki panjang 5 kb.
Lebih dari 90% dari total RNA terdiri dari tRNA dan rRNA. Hanya 1-5% dari total RNA adalah mRNA. Sebuah sel mamalia khas dapat terdiri dari sekitar 500.000 molekul mRNA per sel. Jumlah jenis mRNA tertentu dapat 150.000 kopi per sel.
Cara Mengisolasi mRNA dari Total RNA
Sejumlah teknik biologi molekuler seperti konstruksi perpustakaan cDNA, preparasi sampel untuk preparasi microarray, analisis Northern blot untuk gen yang diekspresikan dengan lemah, dll. memerlukan mRNA berkualitas tinggi. Ada dua metode utama untuk mengisolasi mRNA dari total RNA berdasarkan jenis selnya: metode isolasi mRNA langsung dan metode minus isolasi mRNA.
Metode Langsung Isolasi mRNA
Prinsip pemisahan mRNA matang dari RNA total eukariotik melibatkan seleksi afinitas/kromatografi afinitas mRNA poliadenilasi dengan penggunaan oligo dT (oligodeoxthymidylate), yang melengkapi ekor poli(A). Hal ini dimungkinkan oleh tidak adanya ekor poli(A) pada dua jenis RNA lainnya: tRNA dan rRNA.
mRNA terdiri dari 30-200 nukleotida adenin pada ekor poli(A). Kolom afinitas yang diisi dengan kombinasi oligo dT/carrier digunakan dalam isolasi mRNA dari total RNA. Kombinasi oligo dT/carrier dapat berupa oligo dT yang terikat selulosa, oligo dT yang terbiotinilasi dengan manik-manik magnetik yang digabungkan dengan streptavidin atau manik-manik polistiren-lateks yang digabungkan dengan oligo dT. Semua kondisi eksperimental harus dalam kondisi bebas RNase untuk mencegah pemecahan enzimatik RNA.
Gambar 2: Kromatografi Afinitas
Total RNA harus dilarutkan dalam buffer garam tinggi dan dipanaskan sebentar hingga 65-70 °C untuk mengganggu struktur sekunder RNA. Kondisi untuk isolasi RNA bervariasi di antara kit yang tersedia secara komersial untuk isolasi mRNA. Namun, persiapan poli(A)-RNA atau mRNA terdiri dari tiga langkah.
- Hibridisasi molekul poli(A)-RNA menjadi oligo dT yang terhubung ke pembawa
- Mencuci RNA yang tidak terikat
- Elusi poli(A)-RNA dari kombinasi oligo-dT/carrier dalam kondisi keketatan rendah
Metode Minus Isolasi mRNA
Pemurnian mRNA berbasis oligo dT hanya menghasilkan mRNA dengan ekor poli(A) atau mRNA eukariotik matang. Maka dari itu, metode lain yang dikenal sebagai metode minus dapat digunakan dalam pemurnian mRNA yang tidak memiliki ekor poli(A). Metode ini dapat digunakan dalam isolasi mRNA dari ragi dan RNA total bakteri. Ini juga dapat digunakan dalam isolasi jenis mRNA yang belum matang bersama dengan mRNA matang dari sel eukariotik. Ini melibatkan pengayaan transkriptom dengan menghabiskan RNA ribosom besar dari RNA total. Kit Isolasi Transkriptom RiboMinus TM dari ThermoFisher Scientific menggunakan tiga langkah dalam pemurnian mRNA yang efisien dari ragi dan RNA total bakteri.
- Hibridisasi RNA total dengan rRNA sequence-specific, probe oligonukleotida berlabel 5 biotin
- Penghapusan kompleks probe berlabel rRNA/5′-biotin bersama dengan manik-manik magnetik berlapis streptavidin
- Pemurnian pengotor dan elusi mRNA.
Kata terakhir
Total RNA terdiri dari tiga jenis utama RNA: mRNA, rRNA, dan tRNA. Pemurnian mRNA dari RNA total sangat penting untuk analisis transkriptom organisme tertentu. Metode pemurnian didasarkan pada jenis mRNA. MRNA eukariotik, yang mengandung ekor poli(A), dapat diisolasi dengan kromatografi afinitas dengan oligo dT. MRNA dan mRNA eukariotik yang belum matang dari ragi dan sel bakteri dapat diisolasi dengan menghabiskan rRNA besar dari RNA total.
Sumber bacaan:
- “Ekstraksi mRNA.” Thermo Fisher Scientific, Tersedia di sini . 2. “Ekstraksi RNA berdasarkan Jenis RNA.” Thermo Fisher Scientific, Tersedia di sini .
Sumber gambar:
- “Mature mRNA” (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia 2. “Affinity” Oleh Jamit di Wikibooks Bahasa Inggris – Ditransfer dari en.wikibooks ke Commons oleh Adrignola menggunakan CommonsHelper (Domain Publik) melalui Commons Wikimedia
